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牛奶中β-内酰胺酶檢測方法
點擊次數:165 發布時間:2019-05-10

        “無抗奶”,顧名思義,即不含抗生素的牛奶。早在2002年,這一概念便被提出,“無抗生素”的字樣也登上了乳品包裝。

        為何牛奶含抗生素?

        牛奶中的抗生素來自乳牛,乳牛被注射抗生素,主要是治療乳腺發炎。乳腺炎是奶牛常見病,抗生素的使用是業内“公開的秘密”。牛奶中的抗生素可能導緻飲用者過敏,或因長期接觸抗生素而耐藥。

        如何做到“無抗”?

        藥品合理間隔期後才擠奶,可以生産無抗奶,可以通過檢驗抗生素的方式驗證。

        1、間接法

        方法原理:利用β-内酰胺酶能夠酶解青黴素的原理,向牛奶中添加一定量的青黴素,如果牛奶中存在一定濃度的β-内酰胺酶,那麼青黴素經β-内酰胺酶酶解後濃度會減少,從而判斷牛奶中是否存在β-内酰胺酶。

        實驗步驟:稱取20 g試樣,在4℃、16000rpm條件下離心10 min。取下層清液10 g于50 mL塑料離心管,并将塑料離心管置于37℃中孵育30 min。向孵育後的離心管中加入無水乙醇15 mL。提取30 min後離心,将上層清液過濾紙後收集于梨形瓶中。減壓濃縮蒸發掉乙醇。向旋蒸後的梨形瓶中加入10 mL磷酸鹽緩沖液(pH=8.5),渦旋1 min後調節pH為8.5。以1 mL/min的速度将提取液通過經過預處理的Oasis HLB固相萃取柱,用2 mL磷酸緩沖液(pH=8.5)淋洗萃取柱,再用2 mL水淋洗。MAX後用3 mL乙腈洗脫。将洗脫液在40℃下氮氣吹幹,用0.025 M磷酸鹽緩沖液(pH=7.0)定容殘渣至1 mL,待上機測定。

        色譜條件:LabAlliance PC-2000高效液相色譜配500型紫外檢測器;

          lanbo色譜柱 :C18(4.6mm×150mm×5μm);

          流動相: 甲醇/0.004M 磷酸二氫鉀(pH=4.5)=40/60;

          檢測波長: 268 nm

        2、直接法

        方法原理:牛乳中的青黴素鉀在β-内酰胺酶的作用下,主要生成青黴噻唑酸鉀,并伴随生成少量的青黴胺、青黴醛等物質。經去脂肪、蛋白等前處理後,可以将青黴噻唑酸鉀提取出來,經高效液相色譜儀檢測确認其是否存在,從而判定該牛乳是否為人造“無抗奶”。

        實驗步驟:稱取20 g試樣,在4 ℃、16000 rpm條件下離心10 min。取下層清液10 g于50 mL塑料離心管,加入無水乙醇15 mL,振蕩提取30 min後離心,取清液經0.45 μm的濾膜過濾,用高效液相色譜儀檢測。

        标準溶液配制:稱取0.01 g(精确至0.001 g)青黴素鉀于100 ml容量瓶中,加入1ml市售抗生素分解劑,室溫放置2h使青黴素鉀酶解完全後用去離子水定容,得到青黴噻唑酸鉀标準溶液,濃度100 μg/mL。根據實際情況稀釋後使用。

        色譜條件:LabAlliance PC-2000高效液相色譜配2000型紫外檢測器;

         lanbo色譜柱 :C18(4.6mm×150mm×5μm);

          流動相: 甲醇/0.004 M磷酸二氫鉀(pH=4.5)=40/60;

          檢測波長: 230 nm

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