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細胞傳代培養操作流程
點擊次數:53 發布時間:2019-08-12

       今天小編給大家講解一下細胞傳代培養的實驗過程:

      首先将新鮮培養基置于37℃中回溫,回溫後噴以75%酒精并擦拭之,移入無菌操作台内。如配置:50mL完全培養基(含10%FBS,1%青鍊黴素雙抗)44.5mL基礎培養基 + 5mL FBS + 0.5mL青鍊黴素雙抗。戴防護手套後,自液氮罐中取出冷凍管,檢查蓋子是否旋緊,立即放入37℃水槽中快速解凍(避免冰晶重新結晶而造成細胞死亡),輕搖冷凍管使其在2分鐘内全部融化,以75%酒精擦拭保存管外部,移入無菌操作台内。

      然後将解凍的1mL細胞懸液緩緩加入細胞培養瓶内,再向瓶中加入10mL完全培養基(稀釋比例為1:10),混合均勻,放入37℃,5%中培養。取0.1ml解凍細胞懸液作存活測試。(Sf9細胞在27℃生長,可不需CO2) 。 一般而言,細胞大都不需立即去除冷凍保護劑(例如DMSO)。若要立即去除,則将解凍的細胞懸液加入含有5-10ml培養基之離心管内,離心1300rpm,5分鐘,移去上清液,加入新鮮培養基,混合均勻,放入二氧化碳培養箱培養。若不需立即去除冷凍保存劑,則在解凍培養後隔日更換培養基。
       37℃恒溫培養約48小時,待細胞長滿80-90%後,從培養箱取出75cm2培養瓶,倒掉培養基。加入5mLPBS緩沖液吹打以洗去殘留血清,倒掉緩沖液。沿壁(無細胞的一面)緩緩加入1mL胰酶溶液消化細胞約1min,輕輕搖晃,倒掉殘餘胰酶,将培養瓶置于恒溫箱中約1min,拿出培養瓶輕輕拍打一下細胞貼壁的一面。 

       注意:消化溫度是37℃,加液後用移液管反複吹打分散細胞。 

      向瓶中加入5mL完全培養基,反複吹打均勻2min,從中取出20μl至0.5ml小離心管中,向管中加入80μl台盼藍溶液,混勻,從混合液中取出10μl至蓋好蓋玻片的計數闆上,計算細胞密度及活率。将5mL細胞懸液全部吸出,分别接種1mL懸液到原培養瓶和另一新的培養瓶中,其餘舍棄。再向兩瓶中各加入10mL完全培養基,置于培養。(細胞傳代時按1:5或更大比例稀釋)
    細胞凍存: 
   1. 冷凍前确保細胞處于指數生長期,傳代後的5mL細胞懸液取出1mL接種到培養瓶繼續傳代。另取一無菌離心管,将剩餘4mL細胞懸液置于其中,離心1000rpm,5min(轉速勿超過1500rpm)。 
   2. 離心後倒掉上層清液,收集下層細胞沉澱。向離心管中加入900ul完全培養基,用槍頭反複吹打重懸起細胞。取少量細胞懸液計數細胞濃度及凍前存活率。一般細胞濃度為2~5×106cells/ml較适宜。 
   3. 将細胞懸液轉入1.5mL無菌凍存管中,再加入100ul試劑級DMSO,混勻,制成細胞凍存懸液(DMSO最後濃度為10%)。嚴密封口後,注明細胞名稱、代數、日期,然後進行凍存。 
    注意:對Sf9細胞而言,凍存比例為:95%培養液+5%DMSO。 
   4. 傳統方法:冷存管置于4℃10分鐘→-20℃30分鐘→-80℃16~18小時(隔夜)→液氮罐長期儲存。(-20℃勿超過1小時,防止胞内冰晶過大造成細胞死亡)

 

 

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